• BCM - лабораторная диагностика
• продукты
• Цитология и Гистология

Цитология и Гистология

CISH: Хомогенная гибридизация in situ

В настоящее время существует несколько методов выявления геномных аббераций при различных онкологических заболеваниях: иммуногистохимия (ИГХ), флуоресцентная гибридизация in situ, хромогенная гибридизация in situ, полимеразная цепная реакция.

Классическая иммуногистохимия в качестве зонда использует антитела, то есть этот метод не позволяет определять геномные абберации, а позволяет их лишь предположить, оценивая последствия, такие, например, как увеличение количества белка в клетке, вследствие, например, амплификации гена. Как результат, данный метод имеет очень большую погрешность, ведь увеличение количества белка может наблюдаться и без амплификации гена, а просто вследствие нарушения регуляции экспрессии гена, кодирующего этот белок.

Флуоресцентная гибридизация in situ, хромогенная гибридизация in situ и полимеразная цепная реакция являются методами исследования нуклеиновых кислот, то есть оценивают непосредственно состояние определенного гена, участка ДНК или транскрипта, но разными способами.

Полимеразная цепная реакция чаще используется не столько для диагностики, сколько для мониторинга минимальной остаточной болезни. Например, наборы FusionQuant компании Ipsogen позволяют определить наличие транслокации и следить за уровнем экспрессии гена – продукта этой транслокации по количеству копий РНК химерных генов. В основе флуоресцентной и хромогенной гибридизации in situ лежит специфическое связывание участка ДНК с комплементарным ДНК-зондом. Если речь идет о флуоресцентной гибридизации in situ, то ДНК-зонд коньюгирован с флуоресцентной меткой. Результаты такого исследования оценивают во флуоресцентном микроскопе. В случае хромогенной гибридизации in situ, ДНК-зонд коньюгируют с пероксидазой или чем-либо другим и проводят окрашивание хромогеном. В этом случае результаты оценивают под обычным световым микроскопом.

Гибридизация in situ считается более информативным методом, чем классическая ИГХ. Большое количество литературных данных подтверждает преимущество CISH по сравнению с иммуногистохимическим методом. На сегодняшний день хромогенная гибридизация in situ является более доступным методом, чем флуоресцентная, ввиду того, что ее проведение не требует наличия дорогостоящего флуоресцентного микроскопа, а результат не исчезает с течением времени, как в случае флуоресценции.

Основные достоинства CISH

• Метод предназначен для одновременной детекции геномных аббераций и морфологии ткани под световым микроскопом, используя стандартную иммуногистохимическую технику.
• Легко адаптируемый метод с простой интерпретацией – можно использовать для различных терапевтических областей.

Ниже приведены сравнительные таблицы ИГХ и CISH, а также CISH и FISH.

Сравнение CISH и ИГХ (IHC)

Сравнение FISH с CISH

Метод CISH можно использовать для определения различных геномных аббераций:

Определение транслокаций:

• BCR/ABL для хронического миелолейкоза
• SYT для циновиальной саркомы
• C-myc для лимфомы Буркитта
• EWS для саркомы Эвинга
• MALT для MALT лимфомы

Определение амплификации генов:

• EGFR для рака легких, ободочной и прямой кишки, глиобластомы
• NMYC для нейробластомы
• TopoIIa, Циклин D1 для рака груди

Определение делеций:

• NF2 для шванном и CNS опухолей
• 1p/19q для олигодендроглиомы
• TopoIIa для рака груди

Исследование центромер:

• Хромосома 17 (центромера)
• Хромосомы 3, 7, 8, 9, 10, 11, 18, X (центромеры)
• Хромосома Y, X/Y смесь

Результаты CISH и FISH хорошо коррелируют между собой. Это было показано во многих работах зарубежных исследователей, что приведено в таблице:

На сегодняшний день метод CISH широко используется для диагностики рака груди, для выявления статуса her2 гена. Известно, что в 20-30% первичных исследований больных раком груди обнаруживают гиперэкспрессию HER2 белка. Было показано, что в большинстве случаев гиперэкспрессия белка связана с амплификацией гена her2, то есть с увеличением количества копий her2 гена в геноме клетки. her2 ген расположен на 17 хромосоме. her2 ген – это нормальный компонент, который в диплоидной клетке присутствует в количестве 2-х копий. Определение HER2 статуса сейчас является стандартной диагностикой при инвазивных раках груди. Только в случае если у пациентки наблюдается амплификация her2 гена, ей показана терапия Герциптином.

Для определения статуса her2 гена во многих лабораториях в России используют метод иммуногистохимии. Однако этот метод в данном контексте не является надежной диагностикой. Он способен оценить лишь количество белка в клетке, но не способен ответить на вопрос, что происходит в клетке на генном уровне.

CISH протокол исследования

В основе хромогенной гибридизации in situ лежит специфическое связывание участка ДНК с комплементарным ДНК-зондом. Однако результаты исследования методом CISH напоминают картину, которую наблюдают при использовании техники классической иммуногистохимии. Один ДНК-зонд способен гибридизоваться с одной копией гена в клетке. Таким образом, в нормальной диплоидной клетке, где присутствует 2 копии гена, число окрашенных зондов равно двум. То есть под микроскопом можно наблюдать 2 красных точки. Оценить, присутствует ли амплификация her2 гена просто, необходимо лишь подсчитать количество красных точек на одну клетку. Если это количество не превышает 5-ти точек, то можно утверждать, что амплификации гена her2 в данном образце нет. Если количество точек на одну клетку, больше 5-ти, или вообще представляет собой большой кластер, то в образце присутствует амплификация гена her2 и пациенту показана терапия Герцептином.

1-5 точек = амплификации нет

>10 точек или кластеры = Высокий уровень амплификации

Метод CISH подходит для быстрого и простого исследования транслокаций, наблюдающихся при ряде онкологических заболеваний. Для данной задачи используют два ДНК-зонда к соседним участкам ДНК, между которыми при данной опухоли, часто происходит перестройка. Обычно каждый зонд имеет свой цвет метки, и обмен участками хромосом легко обнаружить в световой микроскоп, просто увидев, что разные по цвету точки расположены на расстоянии друг от друга. При этом необходимо не забывать, что в нормальной диплоидной клетке точек одного цвета должно быть две, причем рядом с каждой точкой одного цвета, должна присутствовать точка другого цвета. При наличие в клетке транслокации, две различные по цвету точки будут находиться рядом, а две другие на расстоянии друг от друга.

Zymed® CISH Транслокации

Пример транслокации: Определение методом CISH C-Myc транслокации, Клетки Raji, 100x иммерсионный объектив.

Оборудование для автоматической денатурации и гибридизации

Гибридизатор SPOT-Light® CISH™ - простой в использовании прибор, который позволяет автоматизировать этапы денатурации и гибридизации в процедурах CISH и FISH. Программируемый гибридизатор уменьшает время ручной работы более чем на 50% и работает без участия оператора, что позволяет экономить время.

Гибридизатор SPOT-Light® CISH™ мобильный и удобный для пользователя. Плотное прилегание крышки обеспечивает оптимальную влажность камеры с образцами и предотвращает высыхание. Вы можете загрузить от 1 до 12 образцов одновременно. Гибридизатор SPOT-Light® CISH™ поддерживает однородную температуру по термоблоку в течение всего времени.

Достоинства прибора:

• Гибридизатор SPOT-Light® CISH™ имеет удобные настройки, которые легко программируются пользователем
• 40 определяемых пользователем программ
• 3 варианта реакции – денатурация/гибридизация; гибридизация и поддержание фиксированной температуры
• Удобный жидкокристаллический экран с подсветкой
• Простая цифровая клавиатура
• Удобное удаление слайдов с использованием встроенных направляющих для слайдов
• Опция нагрева слайдов до фиксированной температуры
• Компактный прибор, который помещается на любом рабочем столе

Информация для заказа:

ЗАО «БиоХимМак» Москва, 119991 Москва, Ленинские горы тел. (495)-647-27-40, факс (495)-939-09-97, e-mail info@biochemmack.ru

• Гистологический манипулятор Веридиум
• "Т-клеточная иммунотерапия"
• CISH: Хромогенная гибридизация in situ