ПЦР
Полимеразная Цепная Реакция
ПЦР - полимеразная цепная реакция - революционный процесс, который позволяет клонировать вне живого тела любой участок ДНК любого организма. А так как набор ДНК является совершенно уникальным у каждого организма, это делает современный ПЦР - анализ высокоспецифичным и точным методом исследования в лаборатории, особенно для выявления возбудителей инфекционных заболеваний или мутантных клеток человеческого организма.
Открыта ПЦР была в 1985 году американским ученым-биохимиком Кэрри Мюллисом, и уже через пару лет были начаты разработки по применению ПЦР в диагностических целях. И в 1993 году, когда стала вполне очевидной ценность этого метода, Кэрри Мюллис получил за открытие ПЦР Нобелевскую премию.
А в практическую диагностику стали активно внедряться стандартизированные тест-системы для ПЦР - диагностики различных заболеваний. Затем разные этапы ПЦР были автоматизированы вплоть до подготовки пробы и учета результатов. Это позволило сделать диагностику с помощью ПЦР действительно простым процессом с максимально точным результатом. Вероятность ложных результатов минимальна благодаря грамотной организации проведения ПЦР, активного внедрения контрольных систем и применения в смеси ПЦР ферментов или химических веществ, избавляющих новый материал исследования от чужеродных попаданий.
Полимеразная цепная реакция - этапный процесс. Первым делом, перед проведением ПЦР, выделяется ДНК или РНК мишени, очищается от баластного белка и концентрируется для повышения чувствительности тестирования. Эти процессы, как и все последующие, в современных диагностических системах, выполняются автоматизировано. Обработанная проба добавляется в ПЦР - смесь для последующего копирования - амплификации. Как раз многократное копирование в пробирке определенных участков ДНК (микроба или вируса) в процессе повторяющихся циклов и составляет суть полимеразной цепной реакции.
Для того чтобы осуществить сам процесс ПЦР, используют заготовленные праймеры - короткие одноцепочечные ДНК, которые и служат в качестве затравки для синтеза выбранного участка ДНК. Но так как этот участок еще состоит из двух цепочек, их нужно разделить, что и проводят путем прогревания при температуре более 90 С в течение одной минуты.
При внесении в исследуемую пробу праймеры прочесывают раствор в поисках участка, которому они комплементарны, то есть, способны присоединится, образовав двунитчатый стартовый участок. Именно такими участками отграничивается специфический фрагмент ДНК, чтобы его можно было многократно воспроизвести. Присоединение праймеров происходит при температуре 50-60 С в течение 1-2 минут. Само воспроизведение ДНК идет с помощью фермента - Taq-полимеразы, также при определенной температуре в течение 2-3 минут для каждой молекулы. Этим заканчивается один цикл реакции.
Синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующих циклах амплификации - это и есть цепная реакция в ПЦР.
В результате количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии и через 25 циклов амплификации синтезируются 106 копий фрагмента. В течение 30-40 циклов, через 15,2 часа, нарабатывается количество ДНК, достаточное, чтобы визуально учитывать результаты реакции после электрофореза или флюоресценции.
При электрофорезе копии-амплификоны подвергаются разгонке под действием электрического тока. Параллельно разгоняют положительные и отрицательные контроли. Если полоса положительного контроля совпадает с полосой амплификона, то это положительный результат, так проводят качественный анализ результатов ПЦР. Чтобы его запротоколировать, после визуального учета результатов, электрофоретическую картину фотографируют и вносят в компьютер.
Существуют и более новые приборы, в которых по мере копирования ДНК, сразу учитывается результат флюорографическим счетчиком, и чертится график флюоресценции.
При этом чувствительность ПЦР достигает всего 10 клеток на всю пробу, что недоступно для всех других тестов. Выбор в качестве амплифицируемого участка ДНК уникального фрагмента генома микроорганизма обеспечивает высокую специфичность ПЦР, которая может быть задана на уровне биовара, вида, рода возбудителя.
Поэтому метод ПЦР и становится "золотым стандартом" при диагностике возбудителей инфекционных заболеваний или клеток опухоли, которые легко могут спрятаться от всех других методов лабораторной диагностики, распространенных на сегодняшний день.
- Лаборатория
- Лабораторная диагностика
- ПЦР
- ПЦР - диагностика
- HLA
- HLA типирование
- Иммунология
- Иммунный статус
- Аллергология
- Остеопороз
- Диагностика остеопороза
